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酶联免疫检测中:ELISA试剂盒操作要点

在进行酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验中,有很 多需要注意的地方,由于ELISA方法广泛应用在各种抗原和抗体的此定中。但是测定中的影响 因素很多,并且对操作有较高的要求,所以,在实验中除了正常的相互反应,还会出现错误的 反应,导致错误的结果。 而造成这种错误的可能因素有:标本因素;试剂因素;操作因素等。 为此,本司针对常见问题做分析如下:

ELISA 试剂盒标准操作要点

无论在什么研究中,优质的试剂、良好的和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠 的必要条件。ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的纯化 水电导率小于1.5μs/cm。

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A 标本的采取和保存

大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血, 红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可 能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性 HRP,也会产生假阳性反应。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,标本在冰箱中 保存时间过长导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。 冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的 血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标 本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。 保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。 抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂 。

B 加样

加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出。推荐阅读:生物学功能评价和检测分析方法的双重间接性

C 保温

在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1 -2小时,产物的生成可达顶峰。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板 孔,反应板不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力 求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成,采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育 中还有边缘效应,边上的值会偏高,建议为了客观的判断结果,将质控放在非边缘位置。

D 洗涤

洗涤在ELISA试剂盒过程中虽不是一个反应步骤,但却决定着实验的成败。ELSIA就是 靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相 抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯 等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格 按要求洗涤,不得马虎。 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离 子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从 而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水 溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在 0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释,应按要求稀释,所用的水电导率 最好在1.5us/cm之下,洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40秒左右,孔内 液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好,手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

E 显色和比色

TMB经HRP 作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2 小时后即可完全消退至 无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这 类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各 类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。酶标比色 仪简称酶标仪,通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有:测 读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可 精确到0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时 室温宜在15~30℃,使用前先预热仪器15-30分钟,测读结果更稳定。 测读A 值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD 用492nm波长。有的酶标仪可用双波长 式测读,即每孔先后测读两次,第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次 测定间不 移动ELISA 板的位置,最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少 由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

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