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elisa竞争法方法学开发

      一般来讲,竞争法实验主要涉及到三个物质,受体,配体和阻断配体受体结合的样品,如PD1受体,PD-L1配体,阻断剂keyturda抗体,也常采用抗原,生物素化抗体,和阻断抗原,生物素化抗体的样品抗体组合。在竞争法开发的初期是建立起受体,配体相互作用的Test system。Test system的条件直接决定了竞争法实验的准确度和测量范围。具体到elisa竞争法方法开发上,主要包含两个方面:

 
    1.设置多个阴性阳性对照组,确认实验信号值是真实代表目标分子配体受体偶联物。主要考察的是在间接的检测过程中elisa反应过程采用的酶标板材,酶联抗体和显色液等试剂耗材是否干扰Test system。如下图所示,严格来讲在新建一个elisa方法时,需要建立一个阳性反应组。推荐阅读:生物学功能评价和检测分析方法的双重间接性
 
elisa
 
    2.包被受体相对于反应配体的剂量曲线。在确认Test system中阳性信号能够代表目标检测分子后,包被少量的受体,2倍梯度稀释反应配体12-16个点进行全曲线拟合,选取EC80或者EC50的配体浓度作为竞争法反应浓度。如下图所示100ng/ml 受体100ul包被,受体从100000ng/ml 2倍梯度稀释到0.2ng/ml,采用不同稀释浓度的酶联抗体进行检测,整个剂量曲线有明显的上,下平台期,不同的酶联浓度对信号的线性传递未造成明显的影响,酶联抗体起到了等比例将信号放大的作用,EC50为12ng/ml,EC80为40ng/ml。可选取100ng/ml 受体100ul包被,配体的竞争浓度选EC80为40ng/ml,酶联稀释度选择1:600以获得较大的信噪比窗口,增加方法测量范围。在竞争法实验中EC80代表了配体在Test system中占据了受体80%的结合位点,配体和受体在此相对状态下,样品对配体和受体的反应的阻断比较敏感。受体过多,可提供的结合位点较多,样品和受体结合不会影响到配体和受体的结合;配体过多,样品加入后相对于配体较少,竞争不过配体,绝大多数配体依旧和受体结合,在两种情况下样品的加入都无法导致Test system发生明显的变化(配体受体偶联物减少),信号变化不明显。
 
    建立好完整的Test system后,就是正式建立竞争法的剂量曲线了。主要包含两个方面的内容:
 
    1.将选定EC80浓度的配体和梯度稀释的样品(2倍梯度稀释12-16个点)混匀后加入包被好受体的酶标板材反应,得到有明显上下渐近线的全曲线。
 
    2.根据实验目的进行,选择样品合适的8个浓度梯度点进行实验,简化实验操作流程,并初步评估方法的质量。具体到应用方面就是亲和力大小比较和定量检测方面。根据笔者的对比研究,发现elisa竞争法相同条件下的同一个曲线在浓度点细微调整下能够满足两方面的需求,这是笔者开创性的发现,希望业界更多的同行能够进行验证。下文会具体进行两方面应用方法的初步评估。v

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